Funktionsweise von PCR-Tests: Die wichtigsten Punkte zum Verständnis

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat sich zu einer der wichtigsten Methoden in der Molekularbiologie und Genetik entwickelt. Es wird verwendet, um einen bestimmten Teil der DNA zu multiplizieren, wodurch Gene identifiziert und untersucht werden können, Krankheiten diagnostiziert, Verwandtschaftsbeziehungen identifiziert und Untersuchungen durchgeführt werden können. Das Funktionsprinzip von PCR-Tests basiert auf der Fähigkeit eines Enzyms - DNA-Polymerase -, den ursprünglichen DNA-Abschnitt zu kopieren und in kurzer Zeit Millionen von Kopien zu erstellen.

Der PCR-Prozess besteht aus mehreren Schritten. Die Denaturierung tritt zuerst auf, wenn die doppelsträngige DNA bei erhöhter Temperatur in zwei getrennte Ketten unterteilt wird. Dann folgt die Annelierung, wenn komplementäre Primer (spezielle kurze einsträngige DNA-Fragmente) verwendet werden, die an die ursprünglichen DNA-Ketten gebunden sind. Eine Proliferation tritt auf, wenn sich die DNA-Polymerase an die Primer anschließt und neue DNA-Ketten synthetisiert. Dann erfolgt die Eliminierung, wenn die überschüssigen Primer entfernt werden und die DNA-Ketten weiter synthetisiert werden. Am Ende erfolgt die Fertigstellung, wenn der Syntheseprozess gestoppt wird und Millionen von Kopien des ursprünglichen DNA-Abschnitts erhalten werden.

Eines der Merkmale von PCR-Tests ist die Verwendung von fluoreszierenden und Sondenmarkern. Bei der Durchführung der PCR wird die Reaktion mit speziellen fluoreszierenden Sonden gekennzeichnet, die an DNA binden und mit einem bestimmten Licht bestrahlt werden. Dies ermöglicht es Ihnen, das Vorhandensein oder Fehlen des gewünschten DNA-Bereichs zu visualisieren.

Grundlegende Prinzipien von PCR-Tests

Die Grundidee von PCR-Tests besteht darin, ein bestimmtes DNA-Fragment durch Fermentation mehrmals zu vergrößern. Der Prozess besteht aus mehreren Schritten:

1. Denaturierung: Die Probe wird zusätzlich erhitzt, so dass sich die doppelsträngige DNA in zwei einzelsträngige DNA teilt.
2. Primer glühen: speziell entwickelte kurze einzelsträngige DNA-Fragmente, Primer genannt, werden an die zielsträngige DNA-Sequenz angehängt.
3. Synthese neuer Ketten: Das Enzym DNA-Polymerase fügt den Grundierungen neue Nukleotide hinzu und bildet neue doppelsträngige DNA-Fragmente.

Dadurch erhöht ein einzelner PCR-Zyklus die Anzahl der gesuchten Sequenz in der Probe um ein Vielfaches. Die Wiederholung von Zyklen (normalerweise 20-40 Mal) ermöglicht es, eine große Menge an DNA für die Analyse zu erhalten.

Für die Durchführung von PCR-Tests sind folgende Komponenten erforderlich:

• Eine DNA-Probe, die die gesuchte Sequenz enthält.
• Primer, spezielle DNA-Fragmente, die an der Verstärkung der gewünschten Sequenz beteiligt sind.
• Das Enzym DNA ist eine Polymerase, die für die Synthese neuer DNA-Ketten verantwortlich ist.
• Desoxyribonukleotide (dNTPs), die Bausteine der DNA, die für die Synthese neuer Schaltungen benötigt werden.
• Pufferlösungen, die optimale Bedingungen für die Reaktion bieten.

Zu den Hauptvorteilen von PCR-Tests gehören hohe Empfindlichkeit und Spezifität, die Möglichkeit, mit einer kleinen Probenmenge zu arbeiten, Geschwindigkeit und einfache Durchführung. Diese Methode ist in der modernen Molekularbiologie und -medizin unverzichtbar geworden und ermöglicht eine effektive und genaue Diagnose und Untersuchung der genetischen Bestandteile lebender Organismen.

Das allgemeine Wesen der Methode

Das Funktionsprinzip des PCR-Tests besteht darin, mehrere Zyklen aufeinanderfolgend durchzuführen: erhitzen, glühen, Elongation. Während des Erwärmungsprozesses wird die Probe einer DNA-Mischung auf eine bestimmte Temperatur erhitzt, bei der die doppelsträngige DNA in zwei einzelsträngige DNA aufgeteilt wird. Dann werden unter Glühbedingungen spezifische Primer hinzugefügt - kurze gleichzeitig synthetisierende DNA-Ketten, die die Startmaterialien für die Synthese neuer DNA-Ketten sind.

Bei der Elongation dienen diese Primer als Matrixketten zur Synthese neuer, komplementärer DNA-Ketten. Dazu wird ein spezielles Enzym verwendet – eine thermostabile DNA-Polymerase. Als Ergebnis dieses Prozesses werden zwei neue doppelsträngige Fragmente erhalten, von denen jedes mit dem ursprünglichen Fragment der genetischen Information identisch ist.

Durch die Durchführung mehrerer Zyklen von Erhitzen, Glühen und Elongation kann somit ein signifikanter Anstieg des ursprünglichen DNA-Fragments erzielt werden. Um das Vorhandensein des gewünschten Fragments zu erkennen, wird eine Fluoreszenzmarkierung verwendet – im Falle der Anwesenheit der richtigen genetischen Sequenzen wird ein bestimmtes Signal reflektiert, das ein positives Testergebnis anzeigt.

DNA-Verstärkung

Der Prozess der DNA-Verstärkung umfasst mehrere Schritte:

1. Denaturierung: In diesem Schritt wird die doppelsträngige DNA in zwei einzelsträngige Moleküle unterteilt. Dies geschieht, wenn die Probe auf eine hohe Temperatur (normalerweise etwa 95 ° C) erhitzt wird, wodurch die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Nukleotidbasen zerstört werden. Dabei werden die Muster- und Matrixketten der DNA getrennt.
2. Instrumentenglühen: In diesem Schritt wird die Temperatur auf den optimalen Wert für die Bindung von Primern reduziert - kurze einsträngige DNA-Fragmente, die als Initiatoren für die Synthese neuer Ketten dienen. Die Primer binden spezifisch an DNA-Sequenzen, die den Endabschnitten des Verstärkungsprodukts entsprechen.
3. Elongation: In diesem Schritt erfolgt das Einwachsen neuer Nukleotide entlang der Primer mit Hilfe von DNA-Polymerase, wodurch eine neue DNA-Kette synthetisiert werden kann. Dies geschieht bei einer Temperatur, die für die Aktivität der verwendeten DNA-Polymerase optimal ist (normalerweise etwa 72 ° C).
4. Zyklen werden wiederholt: Nachdem ein Amplifikationszyklus abgeschlossen ist, wird der Prozess mehrmals wiederholt (normalerweise 30 bis 40 Zyklen), um eine ausreichende Menge an amplifizierter DNA für die Detektion zu erhalten.

Die Verstärkung der DNA ermöglicht es, das Signal eines bestimmten DNA-Fragments zu erhöhen, was die Empfindlichkeit des PCR-Tests erhöht und das Vorhandensein eines Virus oder anderer Krankheitserreger in der Probe erkennt.

Komponenten und Technologie für PCR-Tests

Die Komponenten von PCR-Tests umfassen die folgenden:

• Probe von genetischem Material: es kann DNA oder RNA geben, die aus Gewebezellen oder Flüssigkeiten wie Blut oder Speichel extrahiert wird. Das genetische Material enthält Informationen über das Vorhandensein bestimmter Gene oder DNA/RNA-Sequenzen, die nachgewiesen werden müssen.
• Primer: dies sind kurze DNA-Fragmente, die spezifisch an Zielgene oder Sequenzen binden. Primer werden verwendet, um ausgewählte Bereiche von genetischem Material im PCR-Prozess zu verstärken.
• Thermostabiles Enzym: die Durchführung von PCR erfordert ein spezielles Enzym, bekannt als TA-Polymerase, das ein ausgewähltes Stück genetisches Material kopiert oder verstärkt. Die TA-Polymerase hat die Fähigkeit, hohen Temperaturen standzuhalten und während der Erwärmungs- und Kühlzyklen während des PCR-Prozesses aktiv zu bleiben.
• Desoxyribonukleotide (dNTP): Dies sind Moleküle, die stickstoffhaltige Basen (A, T, G, C) enthalten, die von einem Enzym verwendet werden, um während der Verstärkung eine neue DNA-Kette zu synthetisieren.
• Pufferlösungen: Dies sind Lösungen, die die Bedingungen für die Durchführung von PCR optimieren, einschließlich des richtigen pH-Werts, des Vorhandenseins von Magnesium und anderen notwendigen Komponenten.

Die PCR-Testtechnologie basiert auf der zyklischen Wiederholung von drei Stufen:

1. Denaturierung: Die Probe wird auf eine hohe Temperatur (normalerweise etwa 95 ° C) erhitzt, um die beiden Ketten der doppelsträngigen DNA/RNA in zwei separate Stränge zu trennen.
2. Primer glühen: die Proben werden gekühlt, damit die Primer mit den Zielgenen oder DNA/RNA-Sequenzen in Kontakt kommen können.
3. Extencia: Bei einer niedrigeren Temperatur (normalerweise um 72 ° C) verwendet die TA-Polymerase Desoxyribonukleotide (dNTP), um eine neue DNA-Kette entlang jeder Grundierung zu synthetisieren.

Diese drei Schritte werden viele Male wiederholt (normalerweise 25-35 Zyklen), was zu einer exponentiellen Zunahme der Menge an DNA/RNA führt, die das Zielgen oder die Sequenz enthält. Als Ergebnis dieser Verstärkung kann das Vorhandensein des zielgenetischen Materials in der ursprünglichen Probe nachgewiesen und quantifiziert werden.

PCR-Mischung

Die Zusammensetzung der PCR-Mischung umfasst:

• Eine DNA-Matrix, die eine Zielsequenz von DNA enthält, die während der Reaktion verstärkt wird;
• DNA-Polymerase, die die Synthese neuer komplementärer DNA-Ketten ermöglicht;
• Primer, kurze DNA-Fragmente, die spezifisch an die Ziel-DNA-Sequenz binden;
• Desoxyribonukleotide (dNTP), die Bausteine neuer DNA-Ketten;
• Eine Tamponlösung, die optimale Reaktionsbedingungen einschließlich pH-Wert und Ionenstärke unterstützt;
• Cofaktoren wie Magnesium oder Mangan sind für die Aktivität der DNA-Polymerase notwendig.

Bei einer PCR-Reaktion wird die PCR-Mischung mit der DNA-Probe gemischt und in ein Gewächshaus gelegt, in dem mehrere Erwärmungs- und Kühlzyklen stattfinden. Während des Erhitzens wird die DNA in zwei getrennte Ketten unterteilt, dann binden sich die Primer beim Abkühlen an die Ziel-DNA-Sequenz und die Synthese neuer DNA-Ketten durch die DNA-Polymerase beginnt.

Die PCR-Mischung mit Reagenzien wird vorgemischt und sterilisiert, um die Möglichkeit einer Infektion während des Experiments auszuschließen. Die genaue Zusammensetzung der PCR-Mischung und optimale Reaktionsbedingungen sind die Schlüsselfaktoren für genaue und zuverlässige PCR-Testergebnisse.